[논문] 단일 분자 이미징을 위한 새로운 색상 팔레트 엔지니어링

연구자들은 빛에서 에너지를 흡수하고 재방출하는 민감한 분자인 “형광단”을 화학적으로 부착하여 단백질이나 아미노산과 같은 생체분자를 연구하는 경우가 많습니다.

레이저에 의해 활성화되고 고성능 현미경을 통해 이미지화되면 이러한 형광단 태그 또는 라벨이 무지개색으로 폭발합니다. 색상 그리고 정보. 예를 들어 질병을 감지하거나 유전적 상태를 식별하는 데 도움이 될 수 있는 풍부한 통찰력을 제공합니다.

한 번에 두 가지 이상의 분자 유형을 감지하거나 “다중” 측정을 수행하려면 다양한 색상의 빛을 방출하는 추가 유형의 형광단이 사용됩니다. 그러나 단일 분자 수준에서 서로 다른 색상을 구별하는 것은 놀랍게도 어렵습니다. 이것이 대부분의 현미경이 3~4가지 색상만 보는 이유입니다.

연구자들은 며칠 동안 라벨링 및 이미징을 수행하거나 여러 레이저를 사용하여 복잡한 설정을 사용하는 고급 기술을 사용하여 이러한 색상 장벽을 깨뜨릴 수 있습니다. 그러나 다양한 색상을 볼 수 있는 간단하고 빠른 방법을 찾는 것은 여전히 ​​큰 과제로 남아 있습니다.

UChicago Pritzker School of Molecular Engineering의 연구원들은 이 과제에 대한 새로운 해결책을 제시했습니다. 출판된 논문 오늘 자연나노기술. Squires Lab이 설명하는 새로운 기술은 세 가지 간단한 화학 빌딩 블록을 사용하여 수십 개의 “FRETflur” 태그를 설계하여 연구자들이 생체분자를 라벨링하는 데 사용할 수 있는 더욱 아름답고 미묘한 색상 스펙트럼을 생성합니다.

공동 제1저자인 시카고대 프리츠커 분자 공학 박사인 Jiachong Chu는 “우리의 접근 방식은 더 쉽습니다. 라벨링과 이미징이 한 번이면 됩니다.”라고 말했습니다. 후보자. “이것은 더 적은 비용으로 더 많은 일을 할 수 있다는 것을 의미합니다. 현재 우리의 새로운 기술은 이 분야에서 최고입니다.”

멀티플렉싱을 향한 새로운 길

개별 분자는 작고 세포 샘플은 비교적 거대하고 복잡하며 지저분합니다. PME 팀의 논문에서 그 어느 때보다 더 자세히 설명한 이 연구 분야의 궁극적인 목표는 다중화입니다.

“샘플을 다중화한다는 것은 동일한 측정으로 한 가지 이상의 분자 종을 측정할 수 있다는 것을 의미합니다. 따라서 식별하려는 단백질이 10개, 50개 또는 수백 개 있을 수 있습니다.”라고 Neubauer Family 분자공학 조교수 Allison은 말했습니다. 스콰이어. “이 새로운 기술로 우리는 수십 가지를 할 수 있습니다. 나는 그것을 수백 가지로 확장할 수 있다고 믿습니다.”

이 문제를 해결하기 위해 Squires Lab 팀은 Förster Resonance Energy Transfer(FRET)라는 잘 확립된 기술을 사용하는 혁신적이고 새로운 방법을 발견했습니다. FRET는 빛에 민감한 분자 사이에서 에너지가 전달되는 방식을 설명하는 메커니즘입니다. 이는 연구자들이 분자의 서로 다른 부분 사이의 거리를 측정하거나 두 분자가 상호 작용할 때 보고하는 한 가지 방법입니다. FRET 신호는 UChicago 팀이 FRETflu 라벨을 조정하는 데 사용한 참여 형광단의 특성에 매우 민감합니다.

공동 제1저자인 Ayesha Ejaz 박사는 “이 프로젝트는 FRET를 새로운 방식으로 활용합니다.”라고 말했습니다. 화학과 후보자. “FRET는 생체분자의 거리를 측정하고 역학을 관찰하는 데 일반적으로 사용됩니다. 우리는 다양한 구조를 식별하는 데 사용하는 다양한 FRET 효율성과 기타 특성을 생성하기 위해 기증자와 수용체 염료 사이의 간격을 변경했습니다.”

PME 팀의 연구에 사용된 27개의 태그는 DNA, 녹색 시아닌 염료(Cy3) 및 빨간색 시아닌 염료(Cy5)의 간단한 조합을 사용하여 설계한 27개의 “FRET형광”이었습니다. 다양한 색상으로 빛나는 것 외에도, FRET형광은 각각 광자가 방출되는 타이밍이나 이러한 광자의 방향과 같은 조정 가능한 다른 특성을 나타냅니다.

이러한 특성을 함께 사용하면 초저농도에서 단 몇 분의 1초 만에 FRET플루오르를 식별할 수 있습니다. Ejaz는 이 연구의 가능한 미래 방향 중 하나는 결국 일반 형광단 태그를 이러한 FRET형광으로 대체하는 것이라고 말했습니다.

“보통 사람들은 세포의 여러 부분과 같이 여러 가지를 동시에 보고 싶을 때 특정 색상의 빛을 방출하는 서로 다른 형광 태그로 각 구성 요소에 라벨을 붙입니다. 하지만 형광 태그는 4~5가지 색상으로 제한됩니다. “라고 Ejaz는 말했습니다.

“만약 FRET플루오르를 대신 사용할 수 있다면 형광 현미경 검사에 사용할 수 있는 '색상'의 수를 늘릴 수 있습니다. 우리는 현재 FRET플루오르가 다양한 유형의 실험과 환경에서 얼마나 잘 작동하는지 테스트하고 있으며 이를 통해 모든 것에 대한 더 나은 이해를 얻을 수 있습니다. 가능성.”

“나는 FRETflurs가 실제로 작동하는 모습을 보게 되어 매우 기쁩니다”라고 그녀는 말했습니다.

감도와 단순성

Squires의 경우 새로운 멀티플렉싱 기술의 매력 중 상당 부분은 단순성과 결합된 민감성에서 비롯됩니다.

“모든 사람은 자신이 좋아하는 분석법을 다중화하기를 원하며 특정 상황에서 작동할 수 있는 기존 전략이 많이 있습니다.”라고 그녀는 말했습니다. “시간이 너무 많거나 샘플이 죽어 아무것도 움직이지 않을 때 잘 작동하는 기술이 있습니다.

“우리는 시간이 없는 문제를 공격하고 있습니다. 아직 싸울 시간이 있는 동안 누군가가 어떤 질병을 앓고 있는지 알고 싶거나 아주 작은 샘플만 있고 식별할 수 있는 주사 한 번만 얻을 수 있습니다. 채널을 통해 흐르는 각 분자를 수십 펨토몰 농도까지 단 몇 분의 1초 만에 식별할 수 있습니다.”

FRET형광을 만들기 위해 일반적인 화학 물질을 사용하고 판독을 위해 하나의 레이저만 필요한 기술을 개척함으로써 단순성이 핵심입니다.

Chu는 “우리는 한 번만 표적에 라벨을 붙이고 판독을 한 번만 수행합니다”라고 말했습니다. “이러한 맥락에서 동시에 사용할 수 있는 27개의 서로 다른 태그를 만들 수 있습니다.”

Squires는 더 많은 다중화 이득을 위해 기존 기술을 FRET플루오르와 함께 사용하여 기존 라벨의 판독값을 향상시킬 수 있는 방법을 설명했습니다. “멋진 레이저 여기 방식을 도입하거나 약간 다른 특성을 갖는 다른 형광단을 통합할 수 있습니다”.

이러한 승수를 새롭고 더욱 강력한 기술에 적용하면 새로운 연구 및 응용의 세계가 열릴 수 있다고 Squires는 말했습니다.

Squires는 “이러한 이미징 및 흐름 기반 생물의학 분석의 개선은 차세대 혁신을 가능하게 할 것”이라고 말했습니다.